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FAQ

お客様からお問い合わせの多い項目について纏めました。キラルカラムに関してお困りの際には、ぜひご覧下さい。
  • 1. CHIRALPAK IA/IB/IC/ID(耐溶剤型キラルカラム)と既存のコーティング型キラルカラムの相違点、類似点は何ですか?
  • CHIRALPAK IA/IB/IC/IDと従来の多糖系コーティング型キラルカラムとの最も重要な違いは、移動相に対する堅牢性と安定性です。
    IA/IB/IC/ID充填剤のキラルセレクターは、コーティング型キラルカラムと異なりシリカゲルに固定化されています。この固定化によって、2つの大きな利点があります。
    1つ目は、禁止溶媒の使用によって充填剤の顕著な性能変化やカラムが破壊される心配がなくなります。耐溶剤型キラルカラムはシリカゲル系のHPLC用キラルカラムで使用できる全ての有機溶剤を使用することができます。2つ目は、溶媒選択が大幅に広がることで、従来の移動相(ヘキサン/アルコール)では分離できなかった化合物の分離が期待できます。つまり、耐溶剤型キラルカラムを使用することで多糖系キラルカラムの適用範囲がさらに拡がります。耐溶剤型キラルカラムを用いてメソッド開発する際に、高い成功確率で分離が達成できる新しい溶剤系については、Q7をご参照ください。
    CHIRALPAK IA, IBとコーティング型キラルカラムとの類似点はキラルセレクターです。CHIRALPAK IAのキラルセレクターはCHIRALPAK AD-Hと同じアミロースの3,5-ジメチルフェニルカルバメート誘導体、CHIRALPAK IBのキラルセレクターはCHIRALCEL OD-Hと同じ、セルロースの3.5-ジメチルフェニルカルバメート誘導体です。一方、CHIRALPAK ICはセルロースの3,5-ジクロロフェニルカルバメート誘導体、CHIRALPAK IDはアミロースの3-クロロフェニルカルバメート誘導体というコーティング型キラルカラムにはない新しいキラルセレクターです。ICのキラルセレクターは不斉識別能力が高いことが分かっておりましたが、ヘキサン/アルコール移動相に対して溶解しやすいためにコーティング型としては充填剤にすることができず、耐溶剤型の技術誕生により製品化されたキラルカラムです。
    CHIRALPAK IAとCHIRALPAK AD-H間、CHIRALPAK IBとCHIRALPAK OD-H間での違いは固定相の結合様式にあります。耐溶剤型キラルカラムはポリマーが固定化されることによってわずかに構造に影響を受け、コーティング型と比較すると選択性に若干の違いが見られます。その影響は良い場合も悪い場合もあります。しかし、耐溶剤型キラルカラムの各種溶媒に対する高い安定性や、幅広い種類の溶媒を使用することによる分離向上の可能性を考えると、耐溶剤型キラルカラムをまず選択することをお勧めします。また、上述のように、CHIRALPAK IC/IDはコーティング型充填剤にはないユニークなキラルセレクターであるため、既存の充填剤では得られない「特別な分離」が期待できます。
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  • 2. CHIRALPAK IA/IB/IC/IDはそれぞれどのような違いがあるのでしょうか?
  • 一般に、CHIRALPAK IA/IB/IC/IDの分離適用範囲は相補的であり、それぞれ異なるキラル化合物群を分離することができます(もちろん、1本のカラムだけでなく複数のカラムで分離するサンプルもあります)。
    また、一般にAD-Hで分離する化合物は同じ移動相でIAでも分離が得られる傾向があります。同じく、OD-Hで分離する化合物は同じ移動相でIBでも分離が得られる傾向があります。どちらのケースも、必要に応じて、溶媒の極性を若干変えることで保持時間を調整して下さい。CHIRALPAK IC、IDは上記の2つのカラムと分離可能な化合物が重なることもありますが、特徴的な選択性を示すカラムです。4本のカラムを組み合わせて用い、従来使用している移動相(ヘキサン/アルコール)に加えてさらに広範囲の移動相を使用することで、非常に多くの光学異性体分離が可能となります。
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  • 3. CHIRALPAK IA/IB/IC/IDにはどのような溶媒が使用できますか? 耐溶剤型キラルカラムで使用してはいけない溶媒はありますか?
  • 現在、CHIRALPAK IA/IB/IC/IDにダメージを与える有機溶媒は知られていません。ヘキサン or ヘプタン/アルコール、メタノール、2-プロパノール、エタノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトン、酢酸メチル、MTBE、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルアセトアミド(DMAc)など多くの一般的な有機溶媒を使用することができます。また、カラムを頻繁に使用する場合に生じる不純物による汚れや化合物が溶出しない場合でも、DMF、酢酸エチル、THFをフラッシングすることで手軽に洗浄できます。
    逆相条件で分析する場合、カラムはpH=2.0~pH=9.0の範囲で使用して下さい。ただし、pH≧7.0で分析する場合、ガードカートリッジを用いて、分析温度は25℃以下でご使用ください。さらに、pH≧7.0では少なくとも200インジェクション毎にガードカートリッジを交換してください。
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  • 4. CHIRALPAK IA/IB/IC/IDカラムを使用するとき、移動相以外の溶媒でサンプルを溶解しても良いですか?
  • 一般的に、いかなる場合でもサンプル溶解溶媒には移動相が最適です。移動相よりも溶出力の大きい溶媒で溶解したサンプルを注入する場合にはご注意ください。一般にピークの変形を引き起こす可能性があり、分析結果に影響を及ぼす可能性があります。
    特に分取クロマトグラフィーにおいて、良溶媒で調整された高濃度サンプルを注入すると、溶解性の乏しい移動相と接触することで、カラムの中で析出するという危険があります。もし充填剤とサンプルとの吸着が移動相の溶出力よりも大きければ、さらなる問題が生じます。このような場合、サンプルが充填剤に吸着してカラムの中に残ってしまい、選択性や今後の分取効率に影響を与えます。
    しばしば、サンプル溶解溶媒にジメチルスルホキシド(DMSO)が使用される場合があります。この溶媒は耐溶剤型キラルカラムに対して恒久的な悪影響を与えませんが、移動相組成によってはカラムにDMSOが吸着することがあります。DMSOで希釈したサンプルを繰り返し注入した場合には、CHIRALPAK IAではカラム効率の減少が徐々に引き起こされますが、DMFで時折フラッシングすることにより元に性能に戻すことが出来ます。CHIRALPAK IBでは、DMSOで希釈したサンプルの注入は推奨しておりません。IBではカラムにDMSOが吸着することで、即座に著しいカラム効率の低下を引き起こすためです。DMSOを取り除くために、通液方向とは逆側からフラッシングして下さい。もちろん、固定相は固定化されていますので、一連の操作においてもカラムの安定性には何ら問題ありません。
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  • 5. CHIRALPAK IA/IB/IC/IDカラムを使うメリットは何ですか?私が分析する場合、コーティング型キラルカラムと耐溶剤型キラルカラムのどちらを選べばいいですか?
  • 新しく分離検討を行う場合、特別な事情がなければ、耐溶剤型キラルカラムを選択することを強くお薦めします。耐溶剤型キラルカラムは、コーティング型キラルカラムよりもはるかに安定性が良いからです。また、耐溶剤型キラルカラムは、THFや酢酸エチル、塩素系溶媒といった強力な溶媒に対しても安定して使用できるという利点もあります。これらの溶媒を用いると、従来コーティング型キラルカラムで用いられてきた移動相と比較して、しばしば異なる選択性を示すことがありますので、分離の可能性が高くなります。さらに、分取クロマト用途においても、これらの溶媒の使用によりサンプル溶解性を上げ、分取生産性を飛躍的に高めることができます。
    従来のコーティング型キラルカラムでなければならない事情がある場合(例えば、耐溶剤型キラルカラムではまだ承認されていないバリデートされた分析条件を使用する場合、既存の分析条件で満足な分離が得られる場合)、耐溶剤型キラルカラムよりもコーティング型キラルカラムが適切かも知れません。また、耐溶剤型キラルカラムで色々な溶剤を用いて分析条件を試したが十分な分離が得られていない場合には、コーティング型キラルカラムをご使用ください。
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  • 6. CHIRALPAK IA/IB/IC/IDで使用する有機溶剤や添加剤に違いはありますか?
  • CHIRALPAK IA/IB/IC/IDでも、コーティング型キラルカラムと同様に添加剤-塩基性サンプルを分析する際にはジエチルアミン(DEA)、酸性サンプルを分析する際にはトリフルオロ酢酸(TFA)-を使用することができます。CHIRALPAK IBで塩基性サンプルを分析する場合、添加剤としてDEAを使用するよりも、エタノールアミン(EtNA)、n-ブチルアミン(n-BuA)、特にエチレンジアミン(EDA)を使用した方が、選択性やピーク形状が良くなるケースが多いことがわかっています。
    よく使われる方法として、分離サンプルのアミン官能基に似た構造のアミン官能基を持つ塩基性添加剤を加える方法があります。
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  • 7. 耐溶剤型キラルカラムを使って分離メソッドを開発する場合、どのように進めればよいのでしょうか?
  • 耐溶剤型キラルカラムは、コーティング型キラルカラムよりも溶媒選択の自由度が広がります。サンプルの構造から最適な多糖系キラルカラムを選択することは困難なため、通常カラムスクリーニングを行います。スクリーニングでの成功率が高い4パターンの溶媒の組み合わせがあります。
    下の表は、分離成功率の高いスクリーニングで使われる主な溶媒です。通常、これらの移動相のうち、1種類を使ってスクリーニングを始めます。その結果を見て、適当な保持時間に調整するために溶出力の弱い、または溶出力の強い溶媒組成を採用します。例えば、ピークがあまりにも早く出る場合は、溶出力の弱い移動相を用いる必要があります。CH2Cl2等のハロゲン系溶媒などはコーティング型キラルカラムを破壊します。これらの溶媒は耐溶剤型キラルカラムでのみ使用できます。
    第一推奨
    スクリーニング溶媒
    アルカン※1/
    2-プロパノール
    アルカン※1/
    エタノール
    アルカン※1/MTBE※2/
    エタノール
    アルカン※1/
    CH2Cl2※3(/エタノール)
    一般的な初期条件
    (v/v/v)
    80:20 80:20 0:98:2 50:50
    推奨する組成範囲
    (v/v/v)
    99:1~50:50 99:1~50:50 90:10:0(0:100:0)~
    0:60:40(0:60:40)
    85:15~0:100
    第二推奨
    スクリーニング溶媒
    アルカン※1/
    THF
    アルカン※1/
    酢酸エチル※4
    アルカン※1/
    CHCl3※3
    アセトニトリル/
    アルコール類※5
    メタノール/
    他のアルコール類
    一般的な初期条件
    (v/v/v)
    70:30 50:50 70:30 100:0 100:0
    推奨する組成範囲
    (v/v/v)
    95:5~0:100 80:20~0:100 85:15~0:100 80:20~0:100 100:0~0:100
    ※1 アルカン: n-ヘキサン、iso-ヘキサン、n-ヘプタン。サンプルによってはアルカンの種類によって多少分離が異なることがあります。
    ※2 比較的溶出力の弱いMTBE移動相を用いた場合、エタノールを添加して保持の強さやピーク形状の調節により、良好な分離が得られることがあります。逆に極端に保持の弱い化合物に関してはアルカンとMTBEの混合溶媒系が好適な場合があります。
    ※3 クロロホルム、ジクロロメタンなど比較的溶出力の弱い移動相を使用する場合は、アルコール(エタノール, メタノール, 2-プロパノール)を1~5 %程度添加して保持の強さやピーク形状を調節することによって、より良好な分離が得られることがあります。サンプルの保持が強すぎる場合には、ジクロロメタンに対して~20%のエタノールを添加することが効果的です。
    ※4 保持の強い化合物の場合、アルコール (エタノール, メタノール, 2-プロパノール) または THF を酢酸エチルに添加することによって溶出時間を短くすることができます。
    ※5 アルコール類: メタノール, エタノール, 2-プロパノールあるいはTHF。
    ※6 移動相の選択(特にアセトン、酢酸エチル、トルエン、高濃度のクロロホルム等)とサンプルの構造によっては、UV検出器による検出が困難になる場合があります。その場合は、RI検出器や蒸発光散乱検出器(ELSD)などUV吸収に左右されない検出器をご使用下さい。
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  • 8. 光学分割したいサンプルがあるのですが、どのカラムを使えばいいでしょうか?
  • 弊社では、キラルカラムスクリーニングサービスを行っております。お客様のサンプルに最も適していると考えられるキラルカラム(耐溶剤型キラルカラムとコーティング型キラルカラムの両方を含む)を使用して、最初のスクリーニングを行います。
    不斉中心を2個以上含む化合物の場合、多くの検討が必要になり、スクリーニングと最適化に相応の検討期間が必要になる場合があります。
    分離対象化合物の構造をお送りいただければ、文献検索の技術的なサポートをいたします(お問い合わせフォーム)。構造開示が難しい場合、類似構造を持つ一般的な化合物名、あるいは特定の誘導体の化合物名をお送りいただければ、構造検索を行うことができます。多くの場合、弊社キラルカラムを使用した対象化合物の分離、あるいはその類似化合物の分離がすでに文献で報告されています。この検索をもとに、お客様の化合物に対して最も有望なカラムを推奨いたします。
    キラルカラム選択のためのアプリケーションガイド集には、700例を超える一般的なラセミ化合物の分離データが掲載されています。キラルカラム選択の参考にご覧下さい。
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  • 9. キラルカラムにはどのような溶媒を使用できますか?
  • キラルカラムご使用前に、カラムと一緒に出荷されている取扱説明書を必ずご確認ください。耐溶剤型キラルカラム(CHIRALPAK IA/IB/IC/ID)はどんな溶媒でも使うことができますが、コーティング型キラルカラムでは使用可能溶媒が制限されています。しかし、以下の簡単な予防策を取っていただくだけで、カラム長期間安定して使用することができます。取扱説明書にはカラム毎に使用可能な溶媒が記載されています。取扱説明書の冒頭に書かれている、使用禁止溶媒に関する注意書きを入念にご確認ください。また、混合溶媒として許容範囲にある溶媒もまとめられています。3種類の溶媒の混合は、多糖ポリマーの溶解性が知られておらず、ポリマーの溶解性が高まる可能性もあります。
    耐溶剤型キラルカラムとは大きく異なり、従来のコーティング型キラルカラムではジクロロメタン、クロロホルム、THF、DMSOのような溶媒は絶対に使用しないでください。そのような溶媒を通液すると、カラムヘッドで多糖ポリマーが溶解し、溶媒が希釈されたときにポリマーが再沈殿することによって、カラムが詰まってしまいます。サンプルの溶解溶媒として用いられた、または配管(オートサンプラーのラインを含む)に残っていた使用禁止溶媒が少量でも混入することによって、カラムの性能を低下させる、あるいはカラムを破壊する原因となります。サンプル中に微量に使用禁止溶媒が残存している場合でも、カラムの寿命を短くすることがあります。これらの理由からも、耐溶剤型キラルカラムCHIRALPAK IA/IB/IC/IDの使用をお薦めします。
    特定の溶媒がお客様のカラムで使えるかどうか分からない場合、使用する前に弊社までお問い合わせください(お問い合わせフォーム)。
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  • 10. 逆相条件で分析したいのですが、どのカラムと移動相が使えますか?
  • 多糖誘導体キラルカラムでは、名称にRの付くカラムと耐溶剤型キラルカラムを逆相条件でお使い頂けます。移動相の有機溶媒成分としてTHF、アセトン、ジオキサンなどを使用できるのは耐溶剤型キラルカラムだけですが、アルコール(メタノール、エタノール、2-プロパノール)やアセトニトリルについてはすべてのカラムで使用することができます。一般的な逆相カラムで使用されている水溶液とpHやイオン強度が同じ水溶液であれば、カラムは安定して使えます。
    耐溶剤型キラルカラム、コーティング型キラルカラムともにpH=2~pH=9の範囲で安定に使用することができます。pH=2のギ酸水溶液とpH=9の20mM炭酸水素アンモニウム水溶液(ジエチルアミンでpHを調整)がそれぞれ酸性、塩基性サンプルに対する第1推奨移動相溶媒です。上記条件で満足な分離が得られない場合は、pH=2のリン酸水溶液とpH=9の20mMホウ酸緩衝液をそれぞれ酸性、塩基性サンプルに対してご使用ください。ただし、これらの溶媒は初期検討の推奨条件であるということにご注意ください。より低い濃度の緩衝液、もしくはpH=2からpH=9の間で最も良い分離が得られることが多くあります。また、セルロース系のカラムは、塩基性サンプルに対してイオンペア型クロマトグラフィー挙動を利用した0.1Mヘキサフルオロリン酸カリウム水溶液で良い分離が得られることがあります。
    1.標準的な移動相とその溶媒比
    サンプルの性状 酸性化合物 中性化合物 塩基性化合物
    水溶液 ギ酸水溶液(pH2.0) DEAでpH9.0に調整した20mM
    炭酸水素アンモニウム水溶液
    有機溶媒 アセトニトリル、メタノール、エタノール、2-プロパノール
    標準的な移動相組成 水溶液/有機溶媒※2
    ※2 水溶液/有機溶媒=90/10~0/100の範囲でご使用になれますが、水溶液/アセトニトリル=60/40から検討を始めることをお奨めします。
    2.その他の移動相(1の移動相で十分な分離が得られなかった場合にご使用下さい。)
    サンプルの性状 酸性化合物 塩基性化合物
    アミロース系カラム
    CHIRALPAK AD-RH/AD-3R,AS-RH/AS-3R,
    AY-RH/AY-3R
    50~100mM リン酸緩衝液(pH2.0) 20mMホウ酸緩衝液pH9.0
    リン酸水溶液(pH2.0) -
    セルロース系カラム
    CHIRALCEL OD-RH/OD-3R,OJ-RH/OJ-3R,
    OZ-RH/OZ-3R
    50~100mM リン酸緩衝液(pH2.0) 100mM KPF6(またはNaPF6)水溶液
    リン酸水溶液(pH2.0) リン酸でpH2.0に調整した
    100mM KPF6(NaPF6)水溶液
    リン酸でpH2.0に調整した
    100mM KPF6(NaPF6)水溶液
    -
    耐溶剤型キラルカラムは、上記の条件でもご使用頂けます。
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  • 11. 分離がおかしいのですが、どうすれば元の分離が得られますか?
  • カラムの能力は多くのパラメーターで評価されます。例えば、カラム効率(N)、選択性(α)、分離度(Rs)、ピーク対称性(Ps)、圧損(ΔP)などがあります。カラム性能が変化する原因も、多くのことが考えられます。そのうちのいくつかはキラルカラムに限らず、例えばシリカゲルカラムなどでも起こるものもありますが、弊社のコーティング型キラルカラムにのみ特異的に発生するものもあります。
    一般にカラムに問題が生じていると疑われる場合は取扱説明書をご覧頂き、記載の方法にてカラムを十分に洗浄してください。その上で、カラムに添付してあります出荷検査用紙をご覧頂き、同じ条件にてカラムを検査して下さい。この検査結果が問題の原因追及において重要となります。
    耐溶剤型キラルカラム(CHIRALPAK IA/IB/IC/ID)をご使用の場合、問題解決は簡単であるため、これらのカラムについて先にご説明します。その後、コーティング型キラルカラムについてご説明します。
    カラム圧力
    耐溶剤型キラルカラムにおいては、圧力上昇の主な原因は入り側カラムエンドにあります。サンプルもしくは移動相中の不溶解物が詰まり、圧力上昇を引き起こしています。また、移動相よりも溶解性の良い溶媒に溶解したサンプルを注入しても詰まりが発生することもあります。すなわち、溶解性の低い移動相と混合することでサンプルが析出し、入り側カラムエンドで詰まってしまうという現象です。この問題の解決法は、入り側カラムエンドの洗浄または交換をすることです。ただし、カラムエンドの洗浄や交換は容易ではなく、カラム充填層に悪影響を与える危険がありますのでお薦めできません。カラムエンドのつまりを解消する簡単な手法として、カラムの通液方向とは逆に通液洗浄(逆洗)するという方法があります。もちろん、このようなトラブルを未然に避けるためにもガードカートリッジを使用し、またガードカートリッジを定期的に交換することをお薦めします。
    コーティング型キラルカラムで起こる突然の圧力上昇は、固定相に対する溶媒の影響が考えられます。もし、圧力上昇の原因が固定相にダメージを与える禁止溶媒がカラムに導入されたことによるものであれば、回復することは困難です。これを避けるためには、
    ・カラムを接続する前にHPLC装置全体の溶媒置換を十分に行うこと
    ・サンプルの適切な精製(禁止溶媒の留去)
    ・サンプルの適切な調製(適切な溶媒に溶かす)
    が重要です。サンプルに少量の禁止溶媒が混入していても大きな問題ではないと思われるかもしれませんが、混入した禁止溶媒がキラルポリマーを溶解し、これがカラム性能の急速な低下につながります。そして、カラム効率および選択性の著しい低下がクロマトグラム上でほぼ確実に見られるでしょう。こういった場合、エタノールや2-プロパノールを長時間通液することで多少改善することもありますが、ほとんどの場合、カラムが完全に破壊されているため、カラムの交換が必要となります。
    カラム効率
    多くの場合、カラム効率の変化はピーク対称性、ピーク形状の変化を伴います。まれに、ピーク立ち下りの肩の出現を伴うカラム効率の現象が起こりますが、これはカラムヘッドに空隙が形成されることが原因であると考えられます。この空隙は移動相条件(通常は逆相条件)によるシリカ担体の溶解、カラム耐圧を超える加圧、シリカゲル粒子の破壊、あるいはカラム初期充填問題によることが原因です。購入時にはカラムに同封されている出荷検査用紙に記載している条件でカラムを検査して頂き、使用開始後も定期的に同じ条件で検査をしていただくことで、カラムの性能に変化がないかを確認することができます。カラム効率の喪失の大部分はカラムエンドの部分閉塞(上述)か、カラムヘッドへの物質の吸着が原因と考えられます。
    カラムヘッドへの物質の吸着はサンプルが精製されていない場合、あるいは固定相に強く吸着する成分がサンプル中に含まれている場合に見られます。耐溶剤型キラルカラムをご使用の場合、DMFなどの溶解性の強い溶媒で洗浄することで解決できます。この方法はコーティング型キラルカラムには使用できません。コーティング型キラルカラムの場合は使用可能な溶媒の中で、溶出力が強く相溶性のある2-プロパノールで洗浄します。推奨の洗浄条件で性能が回復しない場合には、さらに強力な洗浄が必要となりますが、この場合カラムが壊れる危険性が大きくなります。この方法についてさらに情報が必要な場合、弊社までお問い合わせ下さい(お問い合わせフォーム)。 しかしながら、この方法は必ず成功するわけではありません。このため、可能な限り耐溶剤型キラルカラムをご使用頂くことを強く推奨します。
    また、時々、新品カラムを使用した場合、設定した分離条件で分離が再現できない場合があります。この現象はロット間差による可能性もありますが、新品カラムとこれまで使用していたカラムとの通液履歴が原因であることがよく見られます。つまり、古いカラムはこれまでの履歴の中で移動相に用いられた有機溶剤が極微量ですが吸着残留し、それが「メモリー効果」として分離に極めて重大な影響を与えている可能性があります。耐溶剤型キラルカラムの場合、カラムにDMFを通液する「リセット」を行うだけでメモリーを除去できます。多くの場合、適切溶媒を含む移動相を新品カラムに数時間通液することでこの問題は解決できます。それでも分離が復元しない場合、異なる移動相、カラム、温度にて分離条件を再検討する必要があるかもしれません。このため、新規の分離検討に入る際には、新品カラムあるいは使用移動相やサンプル履歴を記録したカラムをお使いになることをお勧めいたします。カラムの分離異常に関する質問がありましたらお問い合わせ下さい(お問い合わせフォーム)。お客様の質問に対し、遅滞なく的確に返答したく思いますので、可能な限りの情報をお教えください。
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  • 12. どのような添加剤を、どのような濃度で使用すれば、ピーク形状が改善されますか?
  • 多くの中性あるいは弱酸性、弱塩基性サンプルは添加剤を必要としません。従って、大部分の化合物は、まず無添加にて分析条件の探索(カラムスクリーニング)を実施した方が良いでしょう。強酸あるいは強塩基サンプルは多糖誘導体キラルカラムに吸着しやすく、結果としてピークのテーリングやブロードニングが見られます。この吸着はカラムの担体であるシリカゲルの最も活性な部位で起こります。この問題を克服するためには、この活性部位に選択的に吸着される化合物を移動相に加えます。そうすることで活性部位にはサンプルの代わりに添加化合物が吸着し、サンプルを吸着しなくなります。最も一般的な添加剤は、酸性添加剤としてはトリフルオロ酢酸、塩基性添加剤としてははジエチルアミンです。これらの添加剤は非極性溶媒にも非常によく溶け、順相モードまたは極性有機溶剤モードでよく用いられます。これらの添加剤の2次的利点は、移動相への溶解性が低いサンプルの溶解性を大きく高めることです。ジエチルアミンやトリフルオロ酢酸のような添加剤は移動相に0.5%を上限に加えることができます。一般的な添加量は0.1%です。
    お客様のなかには最初から添加剤を使用して分析条件の探索を考える方もいらっしゃいます。一般的な方法として、ジエチルアミンとトリフルオロ酢酸の両方を移動相に加える方法もあります。スクリーニングで添加剤を使用した場合は、添加剤を入れなくても良いケースがあるため、決定した分析条件を他のカラムで使用する際に添加剤の必要性を注意深く確認する必要があります。
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  • 13. 光学異性体を分け取りたいサンプルがあるのですが、ダイセルではどのようなサービスを提供していますか?
  • 弊社のキラル分離サービスの重要な部分として、受託分取サービスを提供しております。素早く高純度な光学活性体を得たいが、時間がない、または分析条件をスケールアップして単離するための設備がない場合などに、受託分離サービスをご活用下さい。本サービスをご依頼の場合は、弊社の営業担当にお問い合わせ下さい(お問い合わせフォーム)。検討開始にあたり必要がありましたら秘密保持契約を締結致します。最初に、見積もりのためのサンプルを弊社にご提供下さい。弊社の熟練したスタッフが様々なキラルカラムを用い、最適なカラムおよび最適な分取条件を決定します。分取条件が見つかりましたら、分取サービスをご利用頂く場合の見積書を提出させていただきます。 (詳細は受託分取のページをご覧下さい)。
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  • 14. サンプルがヘキサン-アルコールに溶解しません。サンプル溶媒には何を使用したら良いでしょうか?
  • 分析を目的とする場合、通常サンプル濃度を高くする必要はありません。通常は移動相と同じ組成の溶剤に1mg/mlかそれ以下のサンプルを溶解すれば十分です。サンプルが塩基の酸性塩である場合、サンプル溶媒にジエチルアミンを0.1%添加することにより、サンプルが通常より溶解度の高いフリー塩基になり、移動相への溶解性が向上することがあります。逆に、サンプルが酸の塩である場合、トリフルオロ酢酸を0.1%添加することにより、移動相への溶解性が向上することがあります。
    耐溶剤型キラルカラムを使う場合は、サンプルの溶解性が高い他の移動相をお試し下さい。分析目的の場合は、サンプルの注入量が少ないため、サンプル溶解溶媒が結果に与える影響はほとんどありません。特に、選択したサンプル溶解溶媒が移動相と同程度の溶媒強度を持つ場合です。しかし、分取目的の場合には、注入サンプルが移動相と混ざったときに、サンプルが析出する可能性があるので注意が必要です。その場合、移動相の溶解性を上げるために、サンプル溶液に使用する溶媒を移動相に混ぜて使用することをお勧めします。
    コーティング型キラルカラムを使う場合は、サンプル溶媒として、100%メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトニトリルをお試し下さい。これらの極性溶媒は、弊社のほぼ全てのキラルカラムに使用できます。一般的にトルエン、クロロホルム、塩化メチレン、tert-ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジンなどの溶剤をコーティング型キラルカラムへ注入するサンプル溶媒として使用することはお控え下さい。これらの溶媒がサンプルに少量でも含まれている場合、キラルセレクターである多糖誘導体ポリマーが溶出し、カラムの寿命が著しく短くなる可能性があります。
    サンプルが水系溶媒にしか溶解しない場合、IA/IB/IC/ID/AD-RH/AS-RH/AY-RH/OD-RH/OJ-RH/ OZ-RHカラムを、逆相モードで使用してください。逆相モードでは、移動相と希釈溶媒にメタノール/水、エタノール/水、イソプロピルアルコール/水、アセトニトリル/水が使用できます。充填剤ごとの逆相移動相組成の制限については取扱説明書を参照して下さい。キラル固定相の担体であるシリカゲルが溶解することを避けるために、移動相のpHは2~9の間で使用し、特にpH7~9ではガードカートリッジを必ず使用して下さい。
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  • 15. カラムの背圧が高く、適切な流速で運転できません。
  • ダイセルキラルカラムユーザーガイドに明記されている制限圧力は、カラム本体に掛かる圧力のことであり、システム全体に掛かる圧力のことではありません。例えば、通常の運転状態で、カラムを含めたシステム全体に掛かる圧力が10Mpa、カラムを取り除いた状態でのシステム全体に掛かる圧力が3MPaである場合、カラム本体に掛かる圧力は7MPaです。システム圧が高くなることの原因としては、システム内のどこかが閉塞していることが考えられます。配管やインラインフィルター、バルブ部分に詰まりがないかどうかをチェックして下さい。
    カラム自身の圧力が高い場合には、カラムエンドが試料によって閉塞されていることがよくあります。そのような場合、推奨の手順に従って洗浄をすることで詰まりが取り除かれることがあります。また、カラム閉塞の問題を回避するために、分析カラム、あるいは分取カラムの上流側に、取換えが可能なインラインフィルターやガードカラムを常時、取り付けておくことをお勧めします。
    セミ分取カラム使用時の流速は、一般的に分析カラム使用時の流速をカラムの断面積倍した流速とします。セミ分取カラムを使用して高流速で運転する場合、システム中の配管の内径や検出器のセルの容積を大きくする必要があります。あるいは、推奨の上限圧力を超えないように、流速を低く設定する必要があります。
    純粋なエタノールやプロパノールなど、粘度の高い溶媒を移動相として使用すると、背圧が高くなることがあります。そのような場合、推奨の上限圧力を超えないように流速を低く設定して下さい。そのような溶媒を移動相として使用した後でも、粘度の低い溶媒を移動相として使用するときは流速を上げて運転することができます。
    一般に、逆相条件でRHシリーズのカラムを使用する時には、順相条件でHシリーズのカラムを使用する時よりも流速を低く設定する必要があります。RHタイプの逆相カラムは、粘性の高い水系の移動相を使用するため、背圧が高くなりがちです。
    コーティング型キラルカラム使用中に圧力が急激に上昇した場合、深刻な問題が発生している可能性があります。サンプルや移動相に、充填剤にダメージを与えるような物質が少量でも含まれていると、カラムが急激に壊れることがあります。このような状況になると、移動相にキラルセレクターである多糖誘導体ポリマーが溶解、流出してしまい、下流で詰まり、急激に圧力が上昇することがあります。
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  • 16. 分析条件からセミ分取カラムでの分取条件へのスケールアップはどのようにしたら良いでしょうか?また、どのくらいの負荷を乗せられますか?
  • 分析条件からセミ分取での分取条件へのスケールアップは、単純な計算を行うだけで、とても簡単にできます。所有するラセミ体を光学分割することが目的の場合、まずは分析カラムを使用して最大負荷条件を決定して下さい。分離可能な条件が複数ある場合は、それぞれの条件について負荷試験を実施し、最も負荷量を増やすことのできる条件を選択してください。負荷試験を実施する際には、まず目的ラセミ体を移動相と同じ組成の溶媒に、できるだけ高濃度になるように溶解させます。検出波長は、目的物ピークが検出できるような値に設定し、エナンチオマーピーク同士の谷間が上昇するギリギリまで注入量を増やし、過負荷になる直前の注入量を調べます。負荷量の実験値(WE)は、負荷量の実験値(WE)=ラセミ溶液の最大濃度(Cmax)×過負荷になる直前の最大注入量(VAmax)という関係式から求まります。おおよその目安として、分析カラムでの一般的なWE値は1~10mg/injectionです。
    0.46×25cmの分析カラムの相対的な負荷量(LCR)を媒1媒と仮定すると、各カラムサイズでのLCRと流速は下表のようになります。
    「どのくらいの負荷量とすれば良いでしょうか?」という質問の答えは、(WE)×(LCR)によって求まります。分析カラムでの負荷量が一般的な1~10mgであれば、2×25cmのセミ分取カラムでの負荷量は一般に19~190mg/injectionになります。
    カラムサイズ(直径×長さ) 充填材の量(g) 負荷容量(相対値) 流速(ml/min)
    0.46 x 25 cm 2.50 1 1.0
    1 x 25 cm 11.8 5 5.0
    2 x 25 cm 47.4 19 19
    5 x 50 cm 592 250 50
    10 x 50 cm 2370 1000 200
    「どのサイズのカラムを使えば良いですか?」という質問がよくありますが、それは、お客様が何回インジェクションを行うかで決まります。それは以下の式を用いて算出することができ、ご希望のカラムサイズを決定することができます。
    FAQ
    お客様の目的を達成するために必要なカラムのLCRの値はいくらですか?
    例:ある研究者はラセミ体から各光学活性体1gを分離する必要があります。30分間のインターバルでサンプルを注入し、24時間の間に48回注入を行うことを妥当であると判断しました。分析カラムを使用した時の最大負荷量は2mg = 0.002g(各光学活性体1mgずつ)です。48回の注入で各光学活性体1gを取得するために要求されるLCRの値はいくらになりますか?
    求めると以下のようになります。
    FAQ
    表を参照すると、今回、最適なカラムはLCR=19の2×25cmカラムとなります。
    「私が持っているセミ分取カラムにはどれくらいの負荷を乗せられるでしょうか?」という質問がよくあります。それにはまず、分析カラムにより最大負荷量を調べて下さい。セミ分取カラムでの負荷量は、分析カラムでの最大負荷量にセミ分取カラムのLCR値を掛けることで求まります。つまり、WPREP=WE×LCRです。また、分析カラムでの注入量にセミ分取カラムのLCR値を掛けると、そのセミ分取カラムでの注入量が求まります。つまり、VPREP=Vamax×LCRです。
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  • 17. スタンダードタイプのカラムとHシリーズのカラムと3μmのカラムの違いを教えて下さい。
  • コーティング型キラルカラムの場合、旧来品のCHIRALCEL、CHIRALPAKカラムには充填剤に直径10μmの粒子が使用され、HシリーズのCHIRALCEL、CHIRALPAKカラム(商品名にHが付くもの)には直径5μmの粒子が使用され、3μmシリーズのCHIRALCEL、CHIRALPAKカラム(商品名に3が付くもの)には直径3μmの粒子が使用されています。Hシリーズ、3μmシリーズのカラムには、それぞれに対応する旧来品カラムと同じキラル固定相が使用されています。(例えば、ADカラムとAD-HカラムとAD-3は、同じキラル固定相が使用されています。) 充填剤の粒子径が小さくなることにより、スタンダードタイプのカラムと同じ選択性を持ちながら、より高い分離度を発揮します。そのため、Hシリーズのカラムや3μmシリーズのカラムは、旧来品カラムでは困難な分離や不純物のピークが目的成分のピークに重なってしまうような分離に対してより有効的です。分析のスピードを重視する場合は、粒子径の小さい充填剤でカラム長の短いカラムを使用することをお勧めします。逆相用カラムであるRHシリーズは直径5μmの粒子が使用され、各品種に対して3μmの粒子のタイプをご用意しています。
    耐溶剤型キラルカラムに関しては分析用カラムとしては直径5μmの粒子(CHIRALPAK IA/IB/IC/ID)と3μmの粒子(CHIRALPAK IA-3,IB-3,IC-3)が使用されています。
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  • 18. キラルカラムを使用するときに、することとしてはいけないことは何ですか?
  • その1.キラルカラムを使用するときにすること
    1.カラムに同封されている取扱説明書を必ずお読み下さい。
    耐溶剤型キラルカラムとコーティング型キラルカラム、そしてコーティング型キラルカラムでも品種ごとに安定性に大きな違いがあります。
    2.カラムを取り付ける前に、HPLC装置全体(サンプルループ、オートサンプラー洗浄液(使用している場合)、検出器を含む)を適切な溶媒に置換してください。
    3.カラムをできるだけ長くご使用いただくために、推奨溶媒のみを使用してください。推奨溶媒以外の溶媒の使用を検討されている際には、弊社までお問い合わせください。
    注意:推奨溶媒以外の溶媒については、あらゆる混合比での安定性や、長期間使用したときの安定性を評価しているわけではありません。そういった溶媒を継続的に使用することにより、カラムの寿命を著しく短くする可能性もあります。
    4.単純な組成の移動相を使用してください。通常、順相条件カラムでのクロマトグラフ分離は、ヘキサン/2-プロパノール(IPA)=95/5~50/50(v/v)、ヘキサン/エタノール=95/5~50/50(v/v)などの簡単な組成の移動相で達成されます。
    注意: 旧タイプの多糖誘導体カラムの中には、移動相中のアルコール濃度に制限のあるカラムもあります。 (溶媒の使用制限については各カラムに添付されている取扱説明書をご覧下さい。)
    分離条件検討にはHPLC-グレードのエタノールのご使用を推奨します。
    応用:HPLCグレードのエタノールは、5%の2-プロパノールや5%のメタノールの添加で性質が変わることがあります。ただし、絶対にベンゼンやその他のアルコール以外の変性剤で変性させたエタノールは使用しないで下さい。
    5.カラムを取り付け、溶剤を流し始めたら、ベースラインが安定するまでシステムを平衡化してください。 通常、平衡化は1ml/minの流速で最低でも30分かかります。 低流速であったり検出器の感度が高いときには、平衡化にさらに時間がかかる可能性があります。
    6.不溶解物が含まれないサンプルを打ち込んでください。不溶解物がカラムエンドを閉塞させることで非常に多くのカラムのトラブルが生じます。不溶解物から本体カラムを守るために、常にガードカラムまたはインラインフィルター(2μm以下)を使用することをお勧めします。
    7.アキラルな不純物と光学異性体を区別するために、多波長検出器(光学異性体のピークは全ての波長で同じ形状になります)を使用したり、UV検出器と旋光検出器やRI検出器などの異なった検出器を併用されることをお勧めします。複数の不斉中心(キラル中心)があるラセミ化合物であれば、それぞれの組み合わせの光学異性体が全ての波長で同じ吸収強度になります。
    8.カラム内でのサンプル析出やショックピークを抑えるため、移動相と同じ溶媒でサンプルを溶解させてください。移動相にサンプルが溶けない場合は、弊社までご相談下さい。
    9.分析が終了したら、適切な保管用溶媒でカラムを洗浄して下さい。逆相条件で緩衝液を移動相に使用したときには、塩を含まない同じ組成の移動相でカラムを洗浄してから、推奨の保管用溶媒に置換してください。また、移動相に添加剤(酸や塩基など)を使用したときは、添加剤を含んでいない同じ組成の移動相でよくカラムを洗浄してから、保管用溶媒に置換してください。トリフルオロ酢酸(TFA)やジエチルアミン(DEA)といった酸や塩基を移動相の添加剤として使用した場合、一晩であればそのままカラムに移動相が残っていても問題はありません。数日間使用しない場合は、カラムがダメージを受けないよう添加剤を含まない移動相でHPLC装置全体を洗浄することをお勧めします。カラムを長期間使用しない場合は、カラムをHPLC装置から取り外し、カラム内が乾燥することを避けるためにエンドキャップをしっかりと閉めて保管してください。添加剤を使用せずに順相条件で多糖誘導体カラムを使用している場合は、通液せずに1週間以上HPLC装置にカラムを取り付けたままにしておいても問題ありません。多糖系キラルカラムは適切に保管すれば、長期間お使い頂くことができますが、適切でない条件で保管されますと短期間の間にカラムが壊れてしまう可能性があります。
    その2.ダイセルのキラルカラムを使用するときにしてはいけないこと
    1.推奨の最大圧力限界以上でカラムを使用しないで下さい。
    2.カラムの取扱説明書に記載されていない溶媒をサンプル溶解液や移動相に使用しないで下さい。カラムの品種ごとに使用できる溶媒は異なります。あるカラムでよい性能を出した溶媒でも、他のカラムでは使用できないことがあります。
    3.長期間カラムを保管するときは、緩衝液や添加剤をカラム中に残さないで下さい。 取扱説明書に記載されている各カラムに適した推奨の保管方法に従ってください。
    4. カラムに添付されてくる取扱説明書や評価クロマトは大切に保管してください。取扱説明書を捨ててしまったり、なくしてしまったときには、弊社までお問い合わせ下さい(お問い合わせフォーム)。新しいものをお送りします。評価クロマトは、分離に問題が生じたときに、新品のときと比べて同じ分離性能があるかを比較する際にお使いいただけます。
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  • 19. ダイセルのキラルカラムはSFCで使用できますか?
  • ダイセルのキラルカラムはSFCで用いても、高い性能を示します。SFCでは、移動相には主に二酸化炭素が使用されますが、ヘキサンに似た特性があります。一方で、ヘキサンには相溶性がないメタノールであってもSFCでは使用することができ、通常HPLC用キラルカラムで使用できる全ての溶媒(アルコール、アセトニトリル)をモディファイアとして使用することができます。一般に、キラルの選択性はSFCとHPLCで同等ですが、二酸化炭素の拡散速度の速さからSFCの方が高流速での分離の効率が高く、高い分離度が得られます。さらに、HPLCでカルボン酸を分析する場合、移動相に酸性添加剤の添加が必要になりますが、SFCでは添加剤を加えなくてもシャープなピークが得られます。
    カラムにかかる背圧はカラムの安定性に重要であり、SFCの高い圧力がカラムに悪い影響を及ぼすのではないか、と懸念されるかもしれません。しかし、二酸化炭素の低粘性により、カラムにかかる背圧は、HPLCよりもSFCの方がずっと低くなります。そして、ダイセルのカラムはSFC条件下で、非常に安定です。
    SFC用キラルカラムを使用していないときには、SFC装置から外して、カラム内を二酸化炭素から2-プロパノールまたはエタノールに置換し、封をして保管することをお勧めします。ヘキサンを含んだ溶媒で保管すると、ヘキサンを二酸化炭素に効率的に置換できないため、ベースラインがなかなか安定しません。
    注意
    SFCの液化炭酸ガスをボンベから供給し、ポンプで加圧・圧送する作業は、高圧ガス保安法における「高圧ガスの製造」に相当します。そのため、SFCは高圧ガス保安法の適用を受け(分析装置レベルであれば、第ニ種製造設備に該当)、カラムには法規に規定された強度が必要になります。当社では、高圧ガス保安法に規定されたSFCに必要な強度を持ったSFC用キラルカラムをご用意しています。SFC用キラルカラムには、「エンプティカラムの強度計算書」「材料証明書(ミルシート)」「エンプティカラム図面」「耐圧気密試験結果」をお付けしています。
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  • 20. ガードカラムは必要ですか?
  • 分析カラムやセミ分取カラムをご使用の際には、ガードカラムをお使いください。
    充填剤に吸着する不純物や、充填剤を溶解させてしまうような溶媒から本体カラムを保護することを目的としてガードカラムを使用します。本体カラムを長期間安定してお使いいただくために、ガードカラムをご使用になられることを推奨します。
    ガードカラムの交換時期は、クロマトの形状で判断して下さい。
    【チェックポイント】
    ピークの間隔が狭くなってきた
    ピークの形状が悪い(ブロードになった、テーリングが目立ってきたなど)
    システム圧が上がった
    ガードカラムは、分析カラムやセミ分取カラムと同じ充填剤が充填されたガードカートリッジもしくはガードカラムをご使用ください。本体カラムと異なった品種のガードカラムを使用すると、異常吸着などにより分離に悪い影響を及ぼす可能性もあります。
    ガードカラムのカラムエンドは、本体カラムと同じ形状です。ガードカラムと本体カラムを繋ぐため、短い接続用の細い配管をご用意ください。
    3μmシリーズ、耐溶剤型シリーズ、Hシリーズ、R/RHシリーズのガードカラムは、カートリッジタイプになっています。
    ガードカートリッジのご使用には、ガードカートリッジホルダーが必要です。各品種ごとにカートリッジを取り揃えておりますが、ガードカートリッジホルダーはタンパク質系カラムを除く全てのガードカートリッジで共通してお使いいただけます。
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  • 21. ダイセルのキラルカラムでグラジエントをすることはできますか?
  • ダイセルのキラルカラムでグラジエントをすることが、効果的ではないことがあります。グラジエントで時間短縮しても、グラジエントが終了したときのカラム内の移動相を最初の条件まで再び平衡化する時間の方がかかることがあるからです。
    条件検討において、キラルカラムでもグラジエントの効果があるという報告もあります。グラジエントをかけてキラルカラムで分析をするときは、濃度比率の範囲をある程度制限して設定することをお勧めします。このようにすることで、化合物が保持しない場合や全く溶出してこないといった問題を避けられるかもしれません。
    水系移動相の調製法
    《第1推奨移動相》
    ・ギ酸水溶液(pH2)の調整法
    pH2になるまで純水にギ酸を加えます。
    ・20mM炭酸水素アンモニウム水溶液(pH9)の調整法
    1Lのメスフラスコに炭酸水素アンモニウム(NH4HCO3 FW:79.06)を 1.58gを計り取り、純水を標線まで入れます(20mM)。炭酸水素アンモニウム水溶液をビーカーに移し変え、pHメーターを使って、pH9になるまでジエチルアミンを加えます。
    《第2推奨移動相》
    ・リン酸水溶液(pH2)の調製法
    pH2になるまで純水にリン酸を加えます。
    ・20mMホウ酸緩衝液(pH9)の調製法
    1Lのメスフラスコにホウ酸 1.24gを計り取り、純水を標線まで入れます(20mM)。(H3BO3 FW:61.83)。四ホウ酸ナトリウム 7.63gを、2つ目の1Lのメスフラスコに計り取り、純水を標線まで入れて溶解させます。ホウ酸ナトリウム緩衝液 500mlを1Lのビーカーに移し変え、pHメーターを使って、pH9になるまでホウ酸水溶液を加えます。
    ・100mMヘキサフルオロリン酸カリウム緩衝液の調整法
    ヘキサフルオロリン酸カリウム(KPF6 FW:184.07)9.2gを500mlメスフラスコに計りとり、標線まで純水を加えます(100mM)。ヘキサフルオロリン酸カリウム水溶液を1Lビーカーに移し変え、pHメーターを使用して、pH2になるまでリン酸水溶液を加えます。
    《CROWNPAK移動相》
    過塩素酸水溶液pH1の調製法
    市販の70%の過塩素酸水溶液 16.3gを1Lのメスフラスコに計り取り、純水を標線まで加え希釈します。
    他のpHの水溶液は下記の手順で調製することができます。
    1. pH2.0 -- 過塩素酸水溶液pH1 100mlを1Lまでメスアップする。
    2. pH1.5 -- 過塩素酸水溶液pH1 316mlを1Lまでメスアップする。
    3. pH1.3 -- 過塩素酸水溶液pH1 500mlを1Lまでメスアップする。
    (基準量ですので、pHメーターでpHを確認して下さい。)
    過塩素酸移動相に関する重要な安全のための注意
    過塩素酸や過塩素酸イオンは極めて危険な化合物です。過塩素酸や過塩素酸イオンを移動相に使用するのは、分析の目的のみに制限し、過塩素酸緩衝液を分取目的に使用しないで下さい。過塩素酸(もしくは過塩素酸ナトリウム)を含んだ水溶液を濃縮のために加熱すると爆発する可能性があり危険です。初めて過塩素酸緩衝液をご使用になられる方は、過塩素酸や過塩素酸ナトリウムのMSDSをしっかりお読み下さい。