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分離がおかしいのですが、どうすれば元の分離が得られますか?

カラムの能力は多くのパラメーターで評価されます。例えば、カラム効率(N)、選択性(α)、分離度(Rs)、ピーク対称性(Ps)、圧損(ΔP)などがあります。カラム性能が変化する原因も、多くのことが考えられます。そのうちのいくつかはキラルカラムに限らず、例えばシリカゲルカラムなどでも起こるものもありますが、弊社のコーティング型キラルカラムにのみ特異的に発生するものもあります。

 

一般にカラムに問題が生じていると疑われる場合は取扱説明書をご覧頂き、記載の方法にてカラムを十分に洗浄してください。その上で、カラムに添付してあります出荷検査用紙をご覧頂き、同じ条件にてカラムを検査して下さい。この検査結果が問題の原因追及において重要となります。
耐溶剤型キラルカラム(CHIRALPAK IA/IB/IC/ID)をご使用の場合、問題解決は簡単であるため、これらのカラムについて先にご説明します。その後、コーティング型キラルカラムについてご説明します。

 

カラム圧力
耐溶剤型キラルカラムにおいては、圧力上昇の主な原因は入り側カラムエンドにあります。サンプルもしくは移動相中の不溶解物が詰まり、圧力上昇を引き起こしています。また、移動相よりも溶解性の良い溶媒に溶解したサンプルを注入しても詰まりが発生することもあります。すなわち、溶解性の低い移動相と混合することでサンプルが析出し、入り側カラムエンドで詰まってしまうという現象です。この問題の解決法は、入り側カラムエンドの洗浄または交換をすることです。ただし、カラムエンドの洗浄や交換は容易ではなく、カラム充填層に悪影響を与える危険がありますのでお薦めできません。カラムエンドのつまりを解消する簡単な手法として、カラムの通液方向とは逆に通液洗浄(逆洗)するという方法があります。もちろん、このようなトラブルを未然に避けるためにもガードカートリッジを使用し、またガードカートリッジを定期的に交換することをお薦めします。
 

コーティング型キラルカラムで起こる突然の圧力上昇は、固定相に対する溶媒の影響が考えられます。もし、圧力上昇の原因が固定相にダメージを与える禁止溶媒がカラムに導入されたことによるものであれば、回復することは困難です。これを避けるためには、

  • カラムを接続する前にHPLC装置全体の溶媒置換を十分に行うこと
  • サンプルの適切な精製(禁止溶媒の留去)
  • サンプルの適切な調製(適切な溶媒に溶かす)

が重要です。サンプルに少量の禁止溶媒が混入していても大きな問題ではないと思われるかもしれませんが、混入した禁止溶媒がキラルポリマーを溶解し、これがカラム性能の急速な低下につながります。そして、カラム効率および選択性の著しい低下がクロマトグラム上でほぼ確実に見られるでしょう。こういった場合、エタノールや2-プロパノールを長時間通液することで多少改善することもありますが、ほとんどの場合、カラムが完全に破壊されているため、カラムの交換が必要となります。

 


カラム効率
多くの場合、カラム効率の変化はピーク対称性、ピーク形状の変化を伴います。まれに、ピーク立ち下りの肩の出現を伴うカラム効率の現象が起こりますが、これはカラムヘッドに空隙が形成されることが原因であると考えられます。この空隙は移動相条件(通常は逆相条件)によるシリカ担体の溶解、カラム耐圧を超える加圧、シリカゲル粒子の破壊、あるいはカラム初期充填問題によることが原因です。購入時にはカラムに同封されている出荷検査用紙に記載している条件でカラムを検査して頂き、使用開始後も定期的に同じ条件で検査をしていただくことで、カラムの性能に変化がないかを確認することができます。カラム効率の喪失の大部分はカラムエンドの部分閉塞(上述)か、カラムヘッドへの物質の吸着が原因と考えられます。


カラムヘッドへの物質の吸着はサンプルが精製されていない場合、あるいは固定相に強く吸着する成分がサンプル中に含まれている場合に見られます。耐溶剤型キラルカラムをご使用の場合、DMFなどの溶解性の強い溶媒で洗浄することで解決できます。この方法はコーティング型キラルカラムには使用できません。コーティング型キラルカラムの場合は使用可能な溶媒の中で、溶出力が強く相溶性のある2-プロパノールで洗浄します。推奨の洗浄条件で性能が回復しない場合には、さらに強力な洗浄が必要となりますが、この場合カラムが壊れる危険性が大きくなります。この方法についてさらに情報が必要な場合、弊社までお問い合わせ下さい(お問い合わせフォーム)。 しかしながら、この方法は必ず成功するわけではありません。このため、可能な限り耐溶剤型キラルカラムをご使用頂くことを強く推奨します。


また、時々、新品カラムを使用した場合、設定した分離条件で分離が再現できない場合があります。この現象はロット間差による可能性もありますが、新品カラムとこれまで使用していたカラムとの通液履歴が原因であることがよく見られます。つまり、古いカラムはこれまでの履歴の中で移動相に用いられた有機溶剤が極微量ですが吸着残留し、それが「メモリー効果」として分離に極めて重大な影響を与えている可能性があります。耐溶剤型キラルカラムの場合、カラムにDMFを通液する「リセット」を行うだけでメモリーを除去できます。多くの場合、適切溶媒を含む移動相を新品カラムに数時間通液することでこの問題は解決できます。それでも分離が復元しない場合、異なる移動相、カラム、温度にて分離条件を再検討する必要があるかもしれません。このため、新規の分離検討に入る際には、新品カラムあるいは使用移動相やサンプル履歴を記録したカラムをお使いになることをお勧めいたします。カラムの分離異常に関する質問がありましたらお問い合わせ下さい(お問い合わせフォーム)。お客様の質問に対し、遅滞なく的確に返答したく思いますので、可能な限りの情報をお教えください。